Cyanine5.5 maleimide chloride, a CY dye, is a compound characterized by two nitrogen atoms connected by an odd number of methyl units. CY dyes exhibit long wavelengths, adjustable absorption and emission, high extinction coefficient, good water solubility, and relatively simple synthesis [1]. They are commonly used for labeling proteins, antibodies, and small molecules. For protein antibody labeling, the combination can be achieved through a simple mixing reaction, which has reference significance [2].

原液制备：将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。1) 蛋白溶液的 pH 值应为 8.5±0.5，若 pH 低于 8.0，用 1 M 碳酸氢钠调整。2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低，建议蛋白质浓度为 2-10 mg/mL。3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中。染料准备：无水 DMSO 稀释 CY 染料，制成 10 mM 储备溶液，充分混合。CY 储存液应分装后避光保存于 -20 ℃ 或 -80 ℃。染料工作液用量计算：CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10。例如，500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000) 所需 CY 体积为 3.95 μL。计算过程如下 (以 CY3-NHS ester 为例)：1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) × mL (IgG) / MW (IgG) = 2 mg/mL × 0.5 mL / 150,000 mg/mmol = 6.7×10⁻⁶ mmol；2) mmol (CY3-NHS ester) = mmol (IgG) × 10= 6.7×10⁻⁶ mmol × 10 = 6.7×10⁻⁵ mmol；3) μL (CY3-NHS ester) = mmol (CY3-NHS ester) × MW (CY3-NHS ester) / mg/μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10⁻⁵ mmol × 590.15 mg/mmol / 0.01 mg/μL = 3.95 μL。标记反应：1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL CY 染料缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心收集样品至反应管底部，避免剧烈混匀。2) 将反应管置于避光处，室温轻轻摇晃孵育 60 分钟，每隔 10-15 分钟颠倒反应管几次以充分混合。蛋白纯化脱盐：使用 SepHadex G-25 柱。1) 按照说明书制备 SepHadex G-25 柱。2) 将反应混合物装入柱顶部。3) 当样品运行至树脂表面下方时，立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。4) 向样品中加入 PBS (pH 7.2-7.4)，完成柱纯化，收集含有染料-蛋白质缀合物的组分。