Magrose Beads Strep-Tactin

• 纯化条件温和，单步纯化纯度优于His标签，不影响融合后蛋白质的结构和功能。
• 高亲和力，对 Strep-Tag II 标签的结合能力远高于链霉亲和素，填料更高效，能更快速的分离纯化标签蛋白。
• 磁珠可再生，多次使用后仍能保持良好的性能和高效的结合能力。通过适当的再生处理，磁珠表面的活性基团可以大部分恢复，确保其在重复使用过程中依然能够有效地与目标分子结合。

• 适用于任何表达系统中含有Strep-Tag II标签蛋白的分离纯化，包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌等。

注：
a) 磁珠蛋白结合量与目标蛋白特性相关，此处仅做参考值。
b) 1 mL磁珠悬液中含有100 μL磁珠。

1. 缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，适用于多数Strep-Tag II蛋白的纯化，使用时可根据需要进行调整。缓冲液在使用前最好使用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤除菌。
1)Binding/Washing Buffer：10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA，含0.03% Proclin 300, pH 8.0。
2)Elution Buffer：2.5 mM desthiobiotin in Binding Buffer。
3)Regeneration Buffer：0.5 M NaOH or 1 mM HABA in Binding Buffer。

2. 蛋白样品处理
1)大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：用适量Binding/Washing Buffer稀释表达细胞，加入蛋白酶抑制剂（如1 mM PMSF或蛋白酶抑制剂Cocktail C0001），重悬细胞后冰浴超声裂解细胞，即得到粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴30 min，以降解核酸。也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。
2)动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次，吸去上清液，再用适量含1%（v/v） Triton X-100或1%（v/v） NP-40的Binding/Washing Buffer重悬，加入蛋白酶抑制剂，冰浴10 min，即得到粗蛋白样品。
3)胞外表达蛋白：取胞外表达的上清液，用等量的Binding/Washing Buffer稀释，即得到粗蛋白样品。

3. 磁珠预处理
磁珠使用量需要根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算。例如，使用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL的发酵液可收获1 g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为～7 mg，则需要取10 mL 10%的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以此为例介绍操作步骤：
1)将Strep-tag Ⅱ 蛋白纯化磁珠用漩涡振荡器振荡充分混匀，然后使用移液器吸取10 mL磁珠悬液置于15 mL离心管中。将离心管放入磁性分离器，静置1 min，进行磁性分离，吸去上清液，取下离心管。
2)向离心管中加入5-10 mL Binding/Washing Buffer，振荡混匀，使磁珠重新悬浮。接着进行磁性分离，吸去上清液。重复洗涤步骤2次。
注：在进行磁性分离时，为了减少磁珠的损耗，当溶液变澄清后，应先盖紧离心管盖子，保持离心管放置在磁性分离器上。随后，手持磁性分离器与离心管一起上下翻转数次，使澄清的溶液冲刷掉离心管盖上残留的磁珠。静置片刻，待溶液再次变澄清后再进行后续操作。此步骤适用于后续的所有磁性分离过程。

4. 磁珠与目标蛋白结合
1)使用10 mL Binding/Washing Buffer悬浮1 g湿重的菌体，进行破碎和裂解后得到目标粗蛋白样品。将其加入装有预处理磁珠的离心管中，并将离心管放置于漩涡混匀器中振荡15 s。
2)将离心管置于旋转混合仪上，室温下旋转混合20~30 min；或者为了防止目标蛋白降解，也可在2~8℃的低温环境下旋转混合1 h。
3)将离心管进行磁性分离，将上清液移至新的离心管中备用后续检测。取下离心管，进行后续的洗涤步骤。

5. 磁珠洗涤
1)向装有磁珠的离心管中加入5-10 mL Binding/Washing Buffer，旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将清洗液移至新的离心管中备用，以备取样检测。重复洗涤步骤1次。
2)为避免原离心管壁上的非特异性吸附蛋白污染目标蛋白，向装有磁珠的离心管中加入5-10 mL Binding/Washing Buffer，使磁珠重新悬浮后，将磁珠悬液转移至新的离心管中，进行磁性分离，将上清液移至清洗液收集管中。

6. 目标蛋白洗脱
1)根据需要确定洗脱体积以调整目标蛋白浓度，加入2-5 mL Elution Buffer，室温旋转混合2 min，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离。将洗脱液收集到新的离心管中，即得到纯化的目标蛋白样品。
2)为确保目标蛋白完全洗脱，可重复上述步骤1次，再次收集样品于新的离心管中，以检测目标蛋白是否完全洗脱。

7. 磁珠清洗和保存
1)NaOH再生：蛋白洗脱后的磁珠按照以下步骤进行清洗。使用5-10 mL纯化水洗涤3次，再用5-10 mL 0.5M NaOH溶液洗涤3次，随后用5-10 mL纯化水洗涤至中性。最后，加入10 mL保存液，并将磁珠存放于2-8℃环境中保存。
2)HABA再生：若使用脱硫生物素洗脱目标蛋白，磁珠可通过HABA缓冲液进行再生。加入51-0 mL 1mM HABA溶液洗涤磁珠5次，每次洗涤5 min，随后用 Binding Buffer洗涤磁珠至磁珠恢复其原有颜色。最后，加入10 mL保存液，存放于2-8°C环境保存。

8. 蛋白纯化流程的优化
上述操作流程适用于大多数Strep-Tag II 标签蛋白的纯化。根据目标蛋白与Strep-tag Ⅱ 蛋白纯化磁珠的结合性能不同，用户对纯化流程进行优化，以提高目标蛋白的回收率和纯度。
A. 提高目标蛋白回收率的参考方法：
• 延长蛋白溶液与磁珠的孵育时间。
• 添加适当的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解。
• 增加磁珠的用量。
• 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数。
B. 提高目标蛋白纯度的参考方法：
• 添加适当的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解。
• 延长洗涤时间，增加洗涤次数。

4℃，2年。

1. 避免对磁珠进行冷冻、干燥和高速离心等操作。
2. 为了减少磁珠的损失，每次磁性分离的时间不应少于1 min。
3. 从磁珠保存管中取出磁珠之前，应充分震荡以确保均匀悬浮。操作过程中注意避免产生气泡。
4. 建议使用质量较好的移液器吸头和反应管，以避免因磁珠和溶液附着而造成损失。
5. 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠导致翻转离心管无法重悬磁珠，可以使用移液器吹打或瞬时漩涡混合，使磁珠充分重悬。
6. 用户可以根据实际需求保留经磁性分离后移去的上清液，并进行取样检测，以便分析纯化过程并优化蛋白纯化流程。
7. 本产品可以重复使用。当使用过的磁珠在重复使用时，建议继续纯化同种蛋白；如果要纯化不同种类的蛋白，建议使用新的磁珠。
8. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
9. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。